Mikroszkópia

Mikroszkópos vizsgálat egy laboratóriumban

Fénymikroszkópia

Fénymikroszkóp

A fénymikroszkópokban látható fénnyel világítják meg a vizsgált objektumot, amely ezután egy vagy több optikai lencsén halad át. A képet felfoghatja közvetlen az emberi szem, egy fotólemez vagy valamilyen digitális képalkotó eszköz.

Az egyszerű lencsék vagy lencserendszerek és tartozékaik valamint a megfelelő megvilágító rendszer és a mintatartó lemez alkotják a fénymikroszkópokat.

A fénymikroszkópia korlátai

A standard fénymikroszkópia korlátai többek között:

• csak sötét vagy erősen fényvisszaverő felületeket lehet vele hatékonyan vizsgálni.
• a diffrakció miatt a maximális felbontás kb 0,2 mikrométer
• a fókuszsíkból kieső pontok csökkentik a kép tisztaságát.

Különösen az élő sejtekben nincs elegendő kontraszt a jó láthatósághoz, mivel a sejt belső szerkezetei színtelenek és átlátszóak. A kontrasztot leggyakrabban festéssel növelik, a különböző szerkezetekre szelektív festékekkel. de ehhez általában a minta fixálása (megölése) szükséges. A festés növeli az artifaktok számát is, vagyis a képen olyan strukturális részletek jelenhetnek meg, amelyek valójában nincsenek is ott.

Ezeket a korlátokat többnyire áthidalták már különböző speciális technikákkal, melyekkel non-invazív módon tudják növelni a kontrasztot. Ezek a technikák általában a sejtszerkezet részeinek eltérő törésmutatóját használják ki.

A fénymikroszkópia technikái

Fluoreszcenciamikroszkópia

Bizonyos vegyületeket (festékeket) nagyenergiájú (kis hullámhosszú) fénnyel megvilágítva más, alacsonyabb frekvenciájú fényt bocsátanak ki. Ezt a jelenséget fluoreszcenciának nevezik. Néhány mintának önmagában is van fluoreszcens tulajdonsága, az alkotó vegyületektől függően, ezt autofluoreszcenciának nevezik.

A módszer nagyon elterjedt a modern biológiai tudományokban, mivel nagyon érzékeny és segítségével kis molekulák is kimutathatóak. Sok különféle fluoreszcens festék létezik, melyekkel más-más sejtszervecske vagy molekulatípus festhető. Egy különösen sok helyen használható módszer az immunfestés, melynek során egy fluoreszcens molekularészt (fluorokróm) kapcsolnak antitestekhez. Ilyen fluorokrómok például a fluoreszcein vagy a rhodamin.

Az antitestek specifikussá tehetőek egy bizonyos molekulára. Például a DNS alapján mesterséges fehérjéket lehet előállítani. Ezekkel a fehérjékkel nyulakat immunizálnak, akikben a fehérjéhez kötődő antitestek képződnek. Ezekhez az antitestekhez fluorokrómot csatolnak és így követni tudják útjukat a vizsgált sejtekben.

Újabban a zöld fluoreszcens fehérje (green fluorescent protein) és hasonló fehérjék használata terjed. Ezen fehérjék génjét a vizsgálandó fehérjéket kódoló DNS-szakaszhoz kötik. A létrejövő fluoreszcens fehérjerész nem mérgező és általában nem gátolja a fehérje eredeti funkcióját. A genetikailag módosított sejtek maguk készítik el ezeket a fluoreszcens fehérjéket és így funkciójuk in vivo (az élő sejtben) vizsgálható.

Mivel a fluoreszcencia során kibocsátott fény hullámhossza (színe) eltér a megvilágító fényétől, a fluoreszcenciamikroszkóppal alkotott kép általában csak a vizsgálni kívánt (megfestett) rész látható. Ez a nagy specifikusság a fluoreszcenciamikroszkópia széles körű elterjedéséhez vezetett a kutatásban. Különböző struktúrák különböző színű festékekkel festhetőek és ezeket párhuzamosan lehet vizsgálni, vagy külön-külön megfelelő hullámhosszú fényt, vagy fényszűrőt alkalmazva.

Hivatkozások

Jegyzetek:

Általános könyvek a témáról:

• Advanced Light Microscopy vol. 1 Principles and Basic Properties by Maksymilian Pluta, Elsevier (1988)
• Advanced Light Microscopy vol. 2 Specialised Methods by Maksymilian Pluta, Elsevier (1989)
• Introduction to Light Microscopy by S. Bradbury, B. Bracegirdle, BIOS Scientific Publishers (1998)
• Video Microscopy by Shinya Inoue, Plenum Press (1986)
• Microscopy and Imaging Literature
• A review of sub-diffraction microscopy techniques Part I and Part II – a blog post with helpful information, some of which appears in this article

Külső hivatkozások

• Microscopy in Detail – A resource with many illustrations elaborating the most common microscopy techniques
• Images formed by simple microscopes – examples of observations with single-lens microscopes.
• Confocal microscopy theory and protocols Archiválva 2007. június 6-i dátummal a Wayback Machine-ben
• Dark field microscopy page from FSU
• The Science of Spectroscopy Archiválva 2019. március 23-i dátummal a Wayback Machine-ben – supported by NASA. Spectroscopy education wiki and films – introduction to light, its uses in NASA, space science, astronomy, medicine & health, environmental research, and consumer products.
• SVI-wiki on 3D microscopy and deconvolution
• Quantitative Microscopy
• Royal Microscopical Society (RMS)
• Microscopy Society of America (MSA)
• European Microscopy Society (EMS)