„HPLC” változatai közötti eltérés

[[Fájl:Hplc.JPG|jobbra|bélyegkép|300|A HPLC készülék - Balról jobbra: két különböző oldószer gradiensét előállító pumpa, töltött acélkolonna, végül az abszorbanciát mérő detektor]]

 

A vizsgálandó mintát feloldjuk és az oldat kis térfogatát az áramló mozgó fázisba vezetjük (injektáljuk). A minta, miközben keresztülhalad a kolonnán, az álló fázissal való specifikus kémiai vagy fizikai kölcsönhatások révén visszamarad a folyadékáramhoz képest (retardálódik). A visszatartás mértéke a vizsgálandó anyag és az állófázis tulajdonságaitól valamint a mozgó fázis összetételétől függ. Azt az időtartamot, mely alatt egy adott anyag eluálódik (megjelenik a kolonna végén) retenciós időnek nevezzük. Egy adott rendszerben a retenciós idő az egyes vizsgált vegyületek viszonylag egyedi jellemzője. Nagyobb nyomást alkalmazva megnövelhető a lineáris áramlási sebesség, így a komponenseknek kevesebb idejük marad a kolonnán belüli diffúzióra, ami javítja az egyes anyagok közötti elválást. Mozgó fázisként általában vizet és különböző szerves folyadékokat, leggyakrabban [[metanol|metanolt]] ill. [[acetonitril|acetonitrilt]] használnak. A minta komponenseinek jobb elválasztását segíthetik a vízhez adott pufferek vagy [[só]]k, vagy egyéb anyagok, mint például az ionpár képzőként alkalmazott [[trifluorecetsav]].

 

További lehetőséget jelent a HPLC technikánál a mozgó fázis összetételének mérés közbeni változtatása, amit ''gradiens elúciónak'' nevezünk. Például fordított fázisú kromatográfiában a vizsgált anyagok hidrofobicitásának függvényében a mérést kezdhetjük 5% [[metanol]]t tartalmazó mozgó fázissal, majd 25 perc alatt a metanol arányát lineárisan 50%-ra növeljük. Gradiens elúciónál a vizsgálandó keverék komponenseinek elválása függ a komponensnek az aktuális mozgó fázis összetételhez valamint az álló fázishoz való affinitásától. Ez a megoszlási folyamat hasonló a folyadék-folyadék extrakciót jellemző megoszláshoz, azzal az eltéréssel, hogy nem lépcsőzetes, hanem folyamatos. A fenti példában, ahol víz/metanol gradienst használtunk, az erősebb hidrofób tulajdonságot mutató komponensek viszonylag magasabb metanol tartalomnál eluálódnak (a metanol a hidrofóbabb komponens), míg a hidrofil komponensek alacsony metanol/magas víz aránynál eluálódnak. Az oldószerek, adalékanyagok és a gradiens megválasztása az állófázis és a vizsgálandó anyag tulajdonságaitól függ.

 

A normál fázisú HPLC (NP-HPLC) polaritás alapján választja el a vizsgált minta komponenseit, ez volt az elsőként alkalmazott HPLC-s eljárás. Az NP-HPLC poláris álló fázist és apoláris mozgó fázist alkalmaz, viszonylag poláris anyagok elválasztására alkalmazható hatékonyan. A vizsgálni kívánt poláris anyag kapcsolatba lép a poláris álló fázissal s így visszamarad. Az adszorpció erőssége nő a vizsgált anyag polaritásának növekedésével. A poláris komponens és a (mozgó fázishoz képest) poláris álló fázis kölcsönhatásának erősödésével nő a retenciós idő. A kölcsönhatás erőssége nemcsak a vizsgált molekula funkciós csoportjaitól függ, hanem sztérikus tényezőktől is, ezért ezzel a módszerrel szerkezeti izomerek elválasztása is lehetséges.

 

Az NP-HPLC jelentősége az 1970-es években jelentős mértékben lecsökkent a fordított fázisú HPLC fejlődésével párhuzamosan. NP-HPLC esetén jóval kevésbé stabil a retenciós idő, mivel víz vagy más protikus szerves oldószerek megváltoztatják a szilika vagy alumínium-oxid kromatográfiás állófázis hidratáltsági állapotát. Újabban a HILIC állófázisok kifejlesztésével javult a retenciós idő reprodukálhatósága.

 

A fordított fázisú HPLC (''Reversed phase HPLC'', RP-HPLC vagy RPC) esetén az állófázis felülete apoláris, míg a mozgó fázis poláris, jellemzően víz és valamely szerves oldószer elegye. Gyakran használt álló fázis az RMe₂SiCl-dal kezelt szilika, ahol R valamilyen egyenes szénláncú alkil csoport, pl. C₁₈H₃₇ vagy C₈H₁₇. Ilyen álló fázisokat alkalmazva az apolárosabb molekulák retenciós ideje hosszabb, míg a poláros molekulák gyorsabban eluálódnak. Apoláros oldószert adva a mozgó fázishoz növelhetjük, míg hidrofilebb oldószer hozzáadásával pedig csökkenthetjük a retenciós időt. Az RP-HPLC használata annyira elterjedt, hogy gyakran tévesen HPLC-ként emlegetik, minden további pontosítás nélkül. A gyógyszeripar rendszeresen alkalmazza az RP-HPLC-t a gyógyszerek minőségellenőrzése során.

 

Használat után a fordított fázisú kolonnákon tiszta oldószert kell átáramoltatni a savak vagy sók maradékának eltávolítására, majd megfelelő oldószerelegyben kell tárolni. Ha meg akarjuk őrizni a kolonna elválasztó képességét az oszlop fémtartalmát a lehető legalacsonyabban kell tartani. A kolonna fémtartalmának ellenőrzésére alkalmas a következő módszer: injektáljunk 2,2'- és 4,4'- bipiridin elegyét tartalmazó mintát az oszlopra. Mivel a 2,2'-bipiridin [[kelát]]ot képezhet fémionokkal, ezért a 2,2'-bipiridin csúcsa torzul, ha [[fém]] [[ion]]ok vannak jelen a szilika felszínén.

 

A méretkizárásos kromatográfia (angolul: size exclusion chromatography, rövidítve: SEC), melyet ''gél permeációs kromatográfiaként'' vagy ''gélszűréses kromatográfiaként'' is említenek, méret alapján választja el a részecskéket. Általában csak kis felbontás érhető el vele, ezért általában csak a tisztítás utolsó lépéseként használják. Hasznos még tisztított fehérjék harmadlagos vagy negyedleges szerkezetének meghatározásában. Az eljárást széleskörűen alkalmazzák [[poliszacharid]]ok molekulatömegének meghatározására. A méretkizárásos kromatográfia az [[Európai Gyógyszerkönyv]] által is előírt hivatalos módszer a kereskedelmi forgalomban beszerezhető különböző alacsony móltömegű [[heparin]]ok molekulatömegének összehasonlítására.

 

Ioncserés kromatográfia esetén a retenció az oldott ionok és az álló fázishoz kötött töltéssel rendelkező helyek között létrejövő kölcsönhatáson alapszik. Az ugyanolyan töltésű ionok nem kötődnek az oszlopon. Az alábbi ioncserélő típusok ismeretesek:

*Polisztirol gyanták - ezek alkalmasak keresztkötések kialakítására, mellyel növelhető a lánc stabilitása. A keresztkötöttséget növelve nő az ekvilibrálási idő és egyértelműen javul a szelektivitás.

Az ioncserés kromatográfiát a következő területeken alkalmazzák széleskörűen: víztisztítás, nyomokban jelenlevő komponensek elődúsítása, ligandumcsere-kromatográfia, fehérjék ioncserés kromatográfiája, szénhidrátok és oligoszacharidok magas pH-n végzett anioncserés kromatográfiája stb.

 

A kromatográfia e fajtája biológiailag aktív anyagok azon tulajdonságán alapul, hogy képesek stabil, specifikus és reverzibilis komplexek létrehozására. A komplexek létrehozásában az ismert intermolekuláris kölcsönhatások vesznek részt, mint például a [[Van der Waals]] kölcsönhatás, elektrosztatikus kölcsönhatás, dipól-dipól kölcsönhatás, hidrofób kölcsönhatás és hidrogén kötés.

 

Amennyiben a mozgó fázis összetétele az eljárás során állandó ''izokratikus'' áramlásról beszélünk. Ettél eltérően az ún. ''gradiens áramlás'' esetén az elválasztási folyamat során változik a mozgó fázis összetétele. Például egy 20 perces gradiens során a kiindulási 10% metanolt tartalmazó összetétel 90% metanolra változik. A gradiens lehet növekvő vagy csökkenő is. A gradiens elúció előnye, hogy felgyorsíthatjuk az elválasztást, mivel a gyorsabban eluálódó komponensek eltérő körülmények között eluálódnak az oszlopról, mint amelyeknek nagyobb a visszatartásuk a kolonnán. Az oldószer-összetétel megváltoztatásával az elválasztandó komponensek szelektíven jobban vagy kevésbé köthetők a mozgó fázishoz.

 

Az érzékenységet és a vizsgálandó anyag kolonnára vihető mennyiségét befolyásoló kritikus paraméter a HPLC oszlop belső átmérője (Internal diameter - ID). Nagyobb kolonnákkal általában ipari alkalmazásoknál találkozunk, mint például gyógyszer alapanyagok tisztítása során. A szűk átmérőjű kolonnáknak nagyobb az érzékenységük és kisebb az oldószer fogyasztásuk aminek a kis terhelhetőség az ára.

*A nagyobb átmérőjű kolonnákat (10 μm felett) anyagok preparatív célú tisztítására használják nagy töltési kapacitásuk miatt.

*Kapilláris kolonnákat (0,3 μm alatt) szinte csak alternatív detektálási technikákkal, például [[tömegspektrometria|tömegspektrométerrel]] használnak. Általában ömlesztett szilika kapillárisból készülnek, eltérően a nagyobb belső átmérőjű kolonnáknál általánosan használt rozsdamentes acél burkolattól.

 

A tradícionális HPLC technikában a kis gömb alakú [[szilícium-dioxid]] kötött állófázis a leggyakoribb. Ezek a szemcsék több méretben is készülnek, a leginkább használt méret az 5 μm. A kisebb szemcsék általában nagyobb felületet és jobb elválasztást biztosítanak, de az optimális lineáris áramlási sebességhez szükséges nyomás fordítottan arányos a szemcseméret négyzetével. Ez azt jelenti, hogy felére csökkentve a szemcsék méretét a kolonna méretének megtartása mellett kétszeresére növeli a teljesítményt, ám eközben a szükséges nyomás négyszeresére nő. Nagyobb szemcséket peparatív HPLC-nél (kolonna átmérő 5 cm és >30 cm között) és nem HPLC-s alkalmazásoknál, például szilárd fázisú extrakciónál használatosak.

 

Sok álló fázis porózus, hogy nagyobb legyen a fajlagos felület. A kisebb pórusok nagyobb fajlagos felületet biztosítanak, míg a nagy pórusok kinetikai paraméterei jobbak, különösen nagyobb vizsgálandó anyagok esetén. Például egy fehérje molekula, amely nem sokkal kisebb, mint a pórus mérete belemehet a pórusba, de ha egyszer bent van nem könnyen jön ki belőle.

 

Az alkalmazott pumpák nyomáskapacitása eltérő lehet, teljesítményüket aszerint ítéljük meg, hogy mennyire képesek állandó és reprodukálható áramlási sebességet biztosítani. Az elérhető nyomás 400&nbsp;bar. A modern HPLC készülékek ennél magasabb nyomáson is képesek dolgozni, így sokkal kisebb szemcseméretű kolonnák alkalmazására is lehetőség nyílik (<2&nbsp;μm). Ezek az „Ultra High Performance Liquid Chromatography” rendszerek egészen 1000&nbsp;bar nyomásig képesek dolgozni.