Kromatin-immunprecipitáció
A kromatin-immunprecipitáció (ChIP) immunprecipitációs kísérleti technika, amelyet a fehérjék és a DNS közötti kölcsönhatás vizsgálatára használnak. Célja annak meghatározása, hogy specifikus fehérjék kapcsolódnak-e specifikus genomi régiókhoz, például transzkripciós faktorok promoterekhez vagy más DNS-kötő helyekhez való kötődésének/nem-kötődésének megállapítása, és lehetőséget ad a cisztrómok meghtározásához. A ChIP célja, hogy meghatározza a genomban azokat a specifikus helyeket, amelyhez különféle hisztonmódosítások kapcsolódnak, jelezve a hisztonmódosító fehérjék célpontját.[1] A ChIP kulcsfontosságú technológia az epigenomika terén elért előrelépések szempontjából és az epigenetikai jelenségek megismerése szempontjából.[2]
| Ez a szócikk vagy szakasz lektorálásra, tartalmi javításokra szorul. |
Röviden, a módszer hagyományos lépései a következők:
- A DNS és a hozzá kapcsolódó fehérjék keresztkötése élő sejtekben vagy szövetekben a kromatinon (ez a lépés kimarad a natív ChIP-ből).
- A DNS-fehérje komplexeket (kromatin) ezután ~500 bp DNS-fragmensekre daraboljuk ultrahanggal vagy nukleázos emésztéssel.
- A vizsgálni kívánt fehérjével asszociált keresztkötött DNS-darabokat szelektíven immunprecipitáljuk a megfelelő fehérje-specifikus antitest alkalmazásával.
- A fehérjékhez kapcsolt DNS darabokat izoláljuk és meghatározzuk szekvenciájukat. A specifikus DNS-szekvenciák feldúsulása a genom azon régióit képviseli, amelyekhez a kérdéses fehérje in vivo kapcsolódik.
Keresztkötésen alapuló ChIP (XChIP)
szerkesztésA keresztkötésen alapuló ChIP elsősorban transzkripciós faktorok vagy más kromatinasszociált fehérjék DNS-célpontjának feltérképezésére alkalmas, és kiindulási anyagként reverzibilisen keresztkötött kromatint használ. A reverzibilisen keresztkötő szer lehet formaldehid.[3] Ezután a keresztkötött kromatint általában ultrahanggal frgmentáljuk, így 300-1000 bázispár (bp) hosszúságú fragmentumokat kapnak. A 400-500 bp méretű kromatin fragmentumok alkalmasnak bizonyultak ChIP vizsgálatokhoz, mivel két-három nukleoszómát fednek le.
A kromatinban lévő sejttörmeléket ezután centrifúgálással eltávolítják, és a fehérje-DNS komplexeket szelektíven immunprecipitálják a kérdéses fehérje(k) elleni specifikus antitestek felhasználásával. Az antitesteket általában agarózhoz, szefarózhoz vagy mágneses gyöngyökhöz kapcsolják. Az immunprecipitált komplexeket (azaz a gyöngy–antitest–fehérje–cél DNS-szekvencia komplexet) ezután összegyűjtjük és mossuk, hogy eltávolítsuk a nem specifikusan kötött kromatint, a fehérje–DNS keresztkötés felbontjuk, és a fehérjéket proteináz K-val történő emésztéssel eltávolítjuk.
A komplexhez kapcsolódó DNS-t ezután megtisztítják és polimeráz-láncreakcióval (PCR), microarray-ekkel (ChIP-on-chip), molekuláris klónozással és szekvenálással vagy közvetlen nagy áteresztőképességű szekvenálással (ChIP-Seq) azonosítják.
A ChIP-seq
szerkesztésA kromatin-immunprecipitációs szekvenálás, más néven ChIP-seq kísérleti technika, amelyet a transzkripciós faktor kötődési események azonosítására használnak a teljes genomban.
- Carrier ChIP (CChIP): Ez a megközelítés akár 100 sejtet is felhasználhat, ha Drosophila sejteket adnak hozzá hordozókromatinként, hogy csökkentsék a veszteséget és megkönnyítsék a célkromatin kicsapódását. Azonban nagyon specifikus primereket igényel az idegen hordozó kromatin háttérből a célsejt kromatin kimutatása, és ez két-három napot vesz igénybe.[4]
- Fast ChIP (qChIP): A gyors ChIP vizsgálat lerövidítette az időt azáltal, hogy lerövidítette az időt egy tipikus ChIP assay két lépésének lerövidítésével: (i) az ultrahangos fürdő felgyorsítja az antitestek célfehérjékhez való kötődésének sebességét – és ezáltal csökkenti az immunprecipitációs időt (ii) a gyantaalapú (Chelex-100) DNS-izolálási eljárás csökkenti a keresztkötések megfordításának és a DNS izolálásának idejét. A gyors protokoll azonban csak nagy sejtmintákra alkalmas (106-107 tartományban).[5][6] Legfeljebb 24 nyírt kromatin minta feldolgozható, így 5 óra alatt PCR-re kész DNS-t állíthatunk elő, lehetővé téve több kromatin faktor egyidejű vizsgálatát és/vagy a genomiális események több időpontban történő vizsgálatát.[7]
Jegyzetek
szerkesztés- ↑ Collas, Philippe. (2010. január 1.). „The Current State of Chromatin Immunoprecipitation”. Molecular Biotechnology 45 (1), 87–100. o. DOI:10.1007/s12033-009-9239-8. PMID 20077036.
- ↑ Rosenfeld (2013. március 1.). „Systematic optimization of parameters involved in preparation of chromatin and chromatin immunoprecipitation (ChIP) workflow” (angol nyelven). Epigenetics & Chromatin 6 (S1), P122, 1756–8935–6-S1-P122. o. DOI:10.1186/1756-8935-6-S1-P122. ISSN 1756-8935.
- ↑ Jackson, Vaughn (1978. november 1.). „Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent”. Cell 15 (3), 945–54. o. DOI:10.1016/0092-8674(78)90278-7. PMID 569554.
- ↑ O'Neill, Laura P (2006. július 1.). „Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations”. Nature Genetics 38 (7), 835–41. o. DOI:10.1038/ng1820. PMID 16767102.
- ↑ Nelson, Joel D (2006). „Fast chromatin immunoprecipitation assay”. Nucleic Acids Research 34 (1), e2. o. DOI:10.1093/nar/gnj004. PMID 16397291.
- ↑ Nelson, Joel D (2006). „Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method”. Nature Protocols 1 (1), 179–85. o. DOI:10.1038/nprot.2006.27. PMID 17406230.
- ↑ The fast chromatin immunoprecipitation method, Chromatin Immunoprecipitation Assays, 45–57. o.. DOI: 10.1007/978-1-60327-414-2_3 (2009). ISBN 978-1-60327-413-5
Fordítás
szerkesztésEz a szócikk részben vagy egészben a Chromatin immunoprecipitation című angol Wikipédia-szócikk ezen változatának fordításán alapul. Az eredeti cikk szerkesztőit annak laptörténete sorolja fel. Ez a jelzés csupán a megfogalmazás eredetét és a szerzői jogokat jelzi, nem szolgál a cikkben szereplő információk forrásmegjelöléseként.