„HPLC” változatai közötti eltérés
| [ellenőrzött változat] | [ellenőrzött változat] |
Tartalom törölve Tartalom hozzáadva
a Bot: interwikik eltávolítása (Wikidata) |
Nincs szerkesztési összefoglaló |
||
1. sor:
A '''HPLC''', avagy '''nagy teljesítményű folyadékkromatográfia''' (angolul ''High Performance Liquid Chromatography'', vagy ''High Pressure Liquid Chromatography'') a [[biokémia|biokémiában]] és [[analitikai kémia|analitikai kémiában]] vegyületek elválasztására, azonosítására és mennyiségi meghatározására gyakran használt [[kromatográfia|kromatográfiás]] eljárás.
A HPLC rendszer a következő alkotórészekből áll: a kromatográfiás töltetet (állófázist) tartalmazó oszlopból (kolonnából), a mobil fázist (mozgó fázist, eluenst) az oszlopon átnyomó pumpából valamint a molekulák retenciós (visszatartási) idejét jelző detektorból. A retenciós idő az álló fázis, a vizsgált molekula és a mozgó fázis közötti kölcsönhatásoktól függ.
21. sor:
A fordított fázisú HPLC (''Reversed phase HPLC'', RP-HPLC vagy RPC) esetén az állófázis felülete apoláris, míg a mozgó fázis poláris, jellemzően víz és valamely szerves oldószer elegye. Gyakran használt álló fázis az RMe<sub>2</sub>SiCl-dal kezelt szilika, ahol R valamilyen egyenes szénláncú alkil csoport, pl. C<sub>18</sub>H<sub>37</sub> vagy C<sub>8</sub>H<sub>17</sub>. Ilyen álló fázisokat alkalmazva az apolárosabb molekulák retenciós ideje hosszabb, míg a poláros molekulák gyorsabban eluálódnak. Apoláros oldószert adva a mozgó fázishoz csökkenthetjük, míg hidrofilebb oldószer hozzáadásával pedig növelhetjük a retenciós időt. Az RP-HPLC használata annyira elterjedt, hogy gyakran tévesen HPLC-ként emlegetik, minden további pontosítás nélkül. A gyógyszeripar rendszeresen alkalmazza az RP-HPLC-t a gyógyszerek minőségellenőrzése során.
Az RP-HPLC a hidrofób kölcsönhatások elvén működik, mely a poláris mozgó fázis, a viszonylag apoláris vizsgálandó anyag és az apoláris állófázis között működő repulzív erők eredménye. A vizsgálandó anyag kötődése az állófázishoz arányos a vizsgált molekula apoláris szegmense körül a vizes mozgó fázisban a ligandummal való kölcsönhatásban kialakuló érintkező felület területével. A retenció csökkenthető, ha kevésbé poláros oldószert (metanolt, acetonitrilt) adva a mozgó fázishoz csökkentjük a víz felületi feszültségét.
A vizsgált molekula szerkezeti tulajdonságai fontos szerepet töltenek be a retenciós tulajdonságok meghatározásában. Általánosságban elmondhatjuk, hogy a nagyobb, a vízzel kapcsolatba nem lépő, hidrofób felülettel rendelkező vizsgálandó anyagok (C-H, C-C, ill. általában az apoláros kötések, mint pl. az S-S) retenciós ideje hosszabb. Másrészt a poláros csoportok, mint például az -OH, -NH<sub>2</sub>, COO<sup>-</sup> vagy -{{chem|NH|3|+}} visszatartása kisebb, mivel ezek jól elegyednek vízzel. Ugyanakkor a nagyon nagy molekulák esetén a ligandumok alkil láncai és a vizsgált anyag nagy felülete közötti kapcsolat hiányos lehet, valamint a molekulának gondot jelenthet az állófázis pórusaiba való belépés.
29. sor:
További fontos tényező az elválasztás szempontjából a [[pH]] hatása, mivel megváltoztathatja a vizsgált anyag hidrofobicitását. Ezért a legtöbb módszer valamilyen puffert alkalmaz, például [[nátrium-foszfát]]ot, a pH szabályozására. A pufferek több szerepet is betöltenek: szabályozzák a pH-t, semlegesítik az álló fázis felszínén esetleg hozzáférhető maradék szilikát töltését valamint ionpár képző reagensként semlegesítik a vizsgált anyag töltését. Az [[ammónium-formiát]]ot gyakran használják [[Tömegspektrometria|tömegspektrometriás]] detektálás esetén a bizonyos vizsgált molekulák detektálhatóságának növelésére ammónium komplex képződése miatt. Tömegspektrometriás vizsgálatoknál az eluenshez gyakran adnak illékony szerves savakat, például ecetsavat vagy még gyakrabban hangyasavat. Tömegspektrometriás vizsgálatoknál ritkán alkalmaznak trifluor-ecetsavat, mivel felhalmozódik a detektorban és az oldószer szállító rendszerben, de másféle detektálással dolgozó alkalmazásoknál hasznos lehet [[karbonsav]] vegyületek retenciójának növelésében, mivel ez az egyik legerősebb szerves sav. A savak és pufferek hatása az alkalmazástól függ, de általában javítják a kromatográfiás meghatározás minőségét.
A fordított fázisú kolonnák sokkal kevésbé sérülékenyek, mint a normál fázisú szilika oszlopok, bár számos fordított fázisú kolonna alkil-derivatizált szilika szemcséket tartalmaz, melyeket '''soha''' nem szabad vízben oldott bázisokkal használni, mivel ezek lebontják a szilika szemcséket. Vízben oldott savakat használhatunk, de lehetőleg ne tegyük ki a kolonnát túl sokáig savaknak, mivel ezek korrodálhatják a HPLC készülék fém alkatrészeit. Használat után az RP-HPLC kolonnákon tiszta oldószert kell áramoltatni, hogy eltávolítsuk a maradék savakat vagy puffereket, majd a megfelelő oldószer alatt kell őket tárolni.
Használat után a fordított fázisú kolonnákon tiszta oldószert kell átáramoltatni a savak vagy sók maradékának eltávolítására, majd megfelelő oldószerelegyben kell tárolni. Ha meg akarjuk őrizni a kolonna elválasztó képességét az oszlop fémtartalmát a lehető legalacsonyabban kell tartani. A kolonna fémtartalmának ellenőrzésére alkalmas a következő módszer: injektáljunk 2,2'- és 4,4'- bipiridin elegyét tartalmazó mintát az oszlopra. Mivel a 2,2'-bipiridin [[kelát]]ot képezhet fémionokkal, ezért a 2,2'-bipiridin csúcsa torzul, ha [[fém]] [[ion]]ok vannak jelen a szilika felszínén.
| |||